Реакция двойной микродиффузии в агаре

Для диагностики наличия антител предложено большое число серологических реакций. Среди них достойное место занимает метод преципитации в агаре (реакция двойной микродиффузии), который позволяет проводить анализ сложного набора растворимых антигенов и прецепитирующих антител. При этом происходит осаждение антигена — преципитиногена под воздействием специфического антитела — преципитина.

Данная реакция впервые описана Kraus (1897). Модификацией реакции преципитации является диффузионная преципитация в геле — один из наиболее чувствительных методов исследования антигенного состава различных веществ. Находясь в полужидком веществе (агаре), антиген и антитело диффундируют друг к другу с различной скоростью и соединяются в определенных местах, образуя зоны преципитации.

Каждая из этих зон соответствует лишь определенному комплексу антиген — антитело. Впервые эта методика была разработана Oudin (1946), а в дальнейшем модифицирована рядом исследователей.

Д. М. Гольбфарб и Л. Д. Замчук (1968), используя метод преципитации в геле при изучении иммунологии нуклеиновых кислот, приходят к выводу, что при помощи этой реакции можно констатировать антитела даже при небольшом их титре.Мы пользовались методом двойной диффузии в агар по Ouchterlony (1948) в некотором видоизменении. Стандартное предметное стекло тщательно моют, высушивают и предохраняют от пыли. Перед использованием стекла покрываются агаром путем погружения их в 1% раствор.

Покрытые подобным способом предметные стекла просушивают на воздухе, свободном от пыли.Агар желательно готовить для одного или в крайней случае для нескольких опытов, так как постоянное его подогревание изменяет физико-химические свойства. В своей работе мы пользовались обычным агаром, который предварительно очищали: 20 г сухого агар-агара замачивают в 1 л дистиллированной воды, разогревают на огне и добавляют 50 мл 10% раствора хлористого кальция.

Выпавший осадок удаляют. Агар разливают в стеклянную посуду слоем толщиной 1 см и после высыхания разрезают на квадраты с длиной стороны 0,5—1 см. После промывания проточной (48 часов), а затем дистиллированной водой (24 часа со сменой не менее 3—4 раз) агар отжимают от воды, разогревают на кипящей водяной бане и фильтруют через бумажный фильтр 3 раза. К готовому горячему агару добавляют равный объем 1,8% раствора хлористого натрия и мертиолата (1:10 000), затем разливают в стерильные пробирки.

Перед применением агар разогревают на кипящей водяной бане и охлаждают до 60—70°. Приготовленный подобным образом агар является 1% раствором и обладает хорошей прозрачностью.После высушивания стекол с нанесенным агаром на них приклеивают в два слоя две полоски синтетической изоляционной ленты.

Ширина ленты 13—15 мм, расстояние между полосками 20 мм. Приклеенные ленты служат для поддерживания покровного стекла на долю миллиметра над предметным. Покровное стекло помещают на ленты. Под него тонкой стеклянной стерильной пипеткой вводят столько 1% раствора агара, чтобы заполнить все пространство между стеклами (покровным и предметным).

Если агара мало, то не будет контакта его с покровным стеклом. Лучше ввести больше раствора, чтобы агар поднялся по колодцам покровного стекла, а затем из центральной лунки удалять излишки той же стеклянной пипеткой до тех пор, пока агар не сравняется с основанием скошенной части колодца.

Подготовленные по данной методике стекла помещаются в чашки Петри, куда кладут нарезанные кусочки марли. Выдерживание в чашках производят до высыхания агара (10—15 минут). Покровное стекло (Katsh, 1967) представляет собой квадрат со сторонами 25 мм, толщиной в 3 мм, в котором имеется 5 колодцев.

Последние имеют верхнее круглое отверстие диаметром 4 мм, глубиной 2 мм. Затем идет скос 120°. Диаметр основания 1,35 мм, глубина 0,5 мм. Один из колодцев расположен в центре, а другие на 12—3—6 и 9 часах. Расстояние между центрами колодцев 5 мм. Wadsworth (1957), пользуясь описываемой здесь методикой, предлагает подобное же стекло с 6 колодцами.

Можно работать без специального покровного стекла. Агар наливают на стеклянную пластинку и после застывания делают специальными штампами в нем лунки (колодцы).