Реакция двойной микродиффузии в агаре

Вскоре после затвердевания агара колодцы заполняют эквивалентными объемами реагирующих веществ. В центральный помещают эякулят (в качестве антигена), а в боковые — сыворотку крови женщины и мужчины, слизь цервикального канала и т. д. в любой комбинации раствора.Этими веществами колодцы заполняют при помощи индивидуальных шприцев или микропипеток на 1 мл. Для наполнения колодца достаточно 0,01 мл реагента. Заполненные таким образом стекла выдерживают в чашках Петри, на спичках, во влажной среде (мокрые кусочки марли).

Эти чашки можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике. Через 24 часа (в основном раньше) преципитация заканчивается.

После окончания реакции покровное стекло отделяют от агара пальцем, постепенно сдвигая его. Затём предметное стекло помещают в чашку Петри с дистиллированной водой на 1 час, пока все экстрагируемые вещества смоются, для чего препарат легко покачивают. Затем можно просматривать полосы преципитации, лучше в темном поле, под углом к стеклу.

Однако для этого необходим определенный навык. Для контрастности линий преципитации препарат можно окрашивать, для чего применяют тиозин красный (протеиновая окраска).

Промытые влажные стекла (до их высушивания) помещают в раствор тиозина красного (в 100 мл 1% уксусной кислоты растворяют 0,1 г красителя) на 1 час. Время окрашивания зависит от толщины слоя агара и интенсивности полос преципитации. После окраски цветной фон можно удалить промыванием в 1% растворе уксусной кислоты. Затем препарат высушивают и просматривают при помощи лупы, микроскопа с малым увеличением или макроскопически.

Довольно хороший эффект достигается при предварительном окрашивании. К 0,1 мл антител (сыворотка крови, слизь цервикального канала и т. д.) добавляют 0,1 мл кристаллического гематоксилина (несколько кристалликов). Перемешивают описанным выше способом, затем оставляют на стеклянной пластинке до приобретения раствором темно-пурпурной окраски (Katsh, 1967). К 0,1 мл антигена (эякулята) на предметном стекле добавляют 1 каплю 5,7% серной кислоты.

Кислоту и антиген перемешивают путем движения в шприце или микропипетке (Katsh, 1967). Несмотря на добавление серной кислоты, рН которой равен 1,0, не происходит резкого изменения концентрации водородных ионов эякулята. Обладая свойством буферных растворов, рН спермы при этом становится равным 6,9—7,2 (в среднем 7±0,05). рН сыворотки крови и слизи цервикального канала через 10 минут после добавления гематоксилина (в количествах, применяемых по методике) также соответствует нейтральной реакции.

Вначале в боковые колодцы покровного стекла вводят растворы сыворотки крови мужчины и женщины и секрета шейки матки, а через 45 минут заполняют антигеном центральный колодец. Реакция развивается и проходит, как и прежде, во влажной среде в чашках Петри, но в данном варианте в течение нескольких часов. Последующая обработка производится по описанной выше методике.

После высушивания препарата полосы преципитации хорошо различимы невооруженным глазом и могут быть сфотографированы без специального устройства.Ouchterlony (1948) выделял три вида реакции: идентичности, неидентичности и частичной идентичности: 1) полосы преципитации сливаются и становятся четкими.

Это указывает на тождество сравниваемых реагирующих веществ; 2) полосы преципитации перекрещиваются между собой. Это свидетельствует о неспецифичности реакции; 3) полосы преципитаций, сливаясь, образуют «шпору».

В данном случае можно говорить о частичном родстве реагирующих веществ.